盡管如此，現有生物催化體系尚未見直接構建硅手性中心的成功案例。相關研究表明，許多含硅有機物（如α-硅醇類結構）在水溶液中穩定性較低，容易發生分解及消旋化。為了突破這一限制并填補領域空白，本課題開發了基于P450氧化酶的去對稱化生物催化平臺。通過蛋白質工程改造獲得的突變體，其酶活較野生型提高了54倍，可在短時間內完成硅烷底物的選擇性氧化，從而有效規避產物分解與消旋化問題。
近日，北京生命科學研究所 / 清華大學生物醫學交叉研究院劉臻課題組與浙江工業大學楊云芳團隊合作，首次實現了含硅手性中心（Si-stereogenic center）硅醇的酶催化合成。研究人員通過六輪定向進化獲得了優勢突變體ASOx-6，其催化效率（kcat/KM）較野生型P450提升54倍，可高效催化潛手性二氫硅烷的單氧化反應，獲得相應的手性硅醇產物。該平臺兼容多種芳基-烷基取代底物（包括含芳雜環的硅烷），模版底物的總催化轉化數（TTN）可達1,450。
在研究的起始階段，作者首先對于一系列碳氫鍵羥化酶的硅烷氧化活性進行了篩選評估。實驗表明，P450氧化酶對于這一目標反應不僅具有顯著的初始活性以及中等的手性選擇性，更為重要的是，該催化體系中未檢測到二氫硅烷過度氧化的副產物硅烷二醇3a的生成?；谶@一發現，研究人員隨后利用野生型P450酶作為母體，進行了多輪的定向進化。通過針對多個活性位點的定點飽和突變（site-saturation mutagenesis）以及隨機突變（random mutagenesis），作者最終找到了催化這一反應的高活性突變體ASOx-6。在僅使用0.56‰酶載量的條件下，其催化模型底物的效果為81%的收率以及90%的ee值。
隨后，研究人員對于該酶催化系統的底物適用性進行了系統評估。實驗表明，多種芳基-烷基取代的二氫硅烷化合物可以被 ASOx-6選擇性氧化。底物的兼容性包括芳環上不同位置與電性的取代基，或者部分含有雜環的化合物。針對部分中等收率或者較低選擇性的底物，作者并未展開單獨的定向進化，但指出基于蛋白質工程經驗，可以通過類似的進化策略獲得針對性的突變體。
此外，放大反應驗證了該體系的合成潛力：分離的手性硅醇產物經由鉑催化的硅氫化反應，可立體專一性轉化為具有生物活性的硅醇衍生物4a以及4b。
通過DFT計算，作者發現這一催化過程遵循與經典碳氫鍵氧化體系相似的機制，包括氫原子攫取（Hydrogen-atom abstraction）以及氧回彈（Oxygen-rebound）等關鍵反應步驟。計算及競爭性KIE實驗確認了氫原子攫取為反應的產物決定步驟，然而由于硅氫鍵的鍵能顯著低于普通的碳氫鍵鍵能，在這一硅烷氧化體系中，該步驟并非反應的決速步。分子動力學模擬對比顯示：野生型P450BM3與最終變體ASOx-6的近攻擊（near-attack）構象中，底物的pro-R氫原子均保持與鐵氧中間體較近的距離，而關鍵突變使pro-S氫在突變體中與氧中心的平均距離增加。這一變化直接決定了最終變體對于該反應更優的對映選擇性。
?Zhen Liu, Shuang-Yu Dai, Xiahe Chen, Yun-Fang Yang
本項目的實驗部分主要由劉臻實驗室研究生代雙玉完成，計算部分主要由浙江工業大學的陳俠荷博士完成。劉臻研究員和楊云芳研究員為本文的通訊作者。
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202501524
